通過對小鼠進行長達一年的研究，杜克大學的研究人員已經(jīng)證明，使用CRISPR基因組編輯技術(shù)進行治療可以安全，穩(wěn)定地糾正一種名為杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）遺傳性疾病。

該研究于2月18日在線發(fā)表在《Nature Medicine》雜志上。

2016年，Duke的Rooney家族生物醫(yī)學工程副教授Charles Gersbach發(fā)表了一項成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動物模型的方法，其策略有可能轉(zhuǎn)化為人類治療。此后發(fā)表了許多其他的案例，還有更多針對人類疾病的幾種基因組編輯療法目前正處于臨床試驗階段。

Gersbach的研究重點是DMD的小鼠模型，這是由身體無法產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白引起的，肌營養(yǎng)不良蛋白鏈是一種將肌纖維內(nèi)部與周圍支撐結(jié)構(gòu)結(jié)合的長蛋白鏈。

抗肌萎縮蛋白由含有79個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因編碼，稱為外顯子。如果一個或多個外顯子被遺傳突變破壞或刪除，則鏈不會被構(gòu)建，導(dǎo)致肌肉慢慢撕裂并惡化。大多數(shù)患者在10歲時就坐輪椅，并且不能超過20歲或30歲出頭。

自2009年以來，Gersbach一直致力于Duchenne的潛在遺傳治療。他的實驗室是早開始關(guān)注CRISPR / Cas9的實驗室之一，這是一種細菌防御系統(tǒng)的修改版本，可以對入侵病毒的DNA進行定位和切片。他的方法使用CRISPR / Cas9來剪切基因突變周圍的肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子，讓身體的天然DNA修復(fù)系統(tǒng)將剩余的基因重新縫合在一起，以創(chuàng)建一個縮短但功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白基因。

“人們普遍認為，基因編輯會導(dǎo)致性基因改變，”Gersbach說。 “但是，探索可能破壞基因編輯效果的理論可能性非常重要。”因此，這項新研究的目的是探索可能改變基于CRISPR / Cas9的基因編輯的長期影響的因素。

領(lǐng)導(dǎo)這項工作的Gersbach實驗室的博士后研究員克里斯托弗·尼爾森（Christopher Nelson）對攜帶缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白基因的成年和新生小鼠靜脈內(nèi)施用單劑量的CRISPR療法。在接下來的一年中，研究人員測量了成功編輯了多少肌肉細胞以及進行了哪些類型的遺傳改變，以及針對細菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫應(yīng)答的發(fā)生。

其他研究報道，小鼠免疫系統(tǒng)可以對Cas9產(chǎn)生反應(yīng)，這可能會干擾CRISPR療法的益處。一些研究小組還報告說，有些人對Cas9蛋白具有預(yù)先存在的免疫力，這可能是因為之前接觸過細菌宿主。“好消息是，盡管我們觀察到抗體和T細胞對Cas9的反應(yīng)，但似乎都沒有在這些小鼠中產(chǎn)生任何毒性，”作者稱:“這種反應(yīng)也沒有阻止該療法成功編輯肌營養(yǎng)不良蛋白基因并產(chǎn)生長期蛋白質(zhì)表達的能力。”

然而，作者承認，小鼠免疫系統(tǒng)的功能通常與人體免疫系統(tǒng)*不同。新生兒DMD篩查目前尚未廣泛開展;大多數(shù)Duchenne診斷發(fā)生在兒童三至五歲時。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，Gersbach說在治療期間抑制免疫系統(tǒng)活性可能是一種可行的方法。

此外，研究人員還在研究限制Cas9僅在短時間內(nèi)表達或遞送至肌肉細胞的潛在策略，這可能會減少免疫檢測。

作者此前曾調(diào)查過CRISPR / Cas9的脫靶編輯潛力，無意中修改了基因組中的其他位點，并報告了可能脫靶位點的小活性。然而，近的其他研究報道，CRISPR有時可以在正確的位點進行基因編輯，但不能以預(yù)期的方式進行。例如，一些研究表明，CRISPR可以切除比預(yù)期大得多的遺傳切片，或者DNA的可以嵌入切割位點。之前在基因組編輯研究中未報告這些類型的編輯，因為所使用的方法僅檢測到預(yù)期的編輯。

為了全面地繪制肌營養(yǎng)不良蛋白基因中發(fā)生的所有編輯，作者進行了DNA測序。令人驚訝的是，除了目標外顯子的預(yù)期去除之外，還發(fā)生了許多類型的編輯，包括從編碼CRISPR / Cas9系統(tǒng)的病毒載體中高度插入DNA序列。

根據(jù)組織的類型和CRISPR的使用劑量，多達一半的目標編輯導(dǎo)致這些替代序列變化。盡管該結(jié)果令人驚訝，但是非預(yù)期的序列變化似乎不會影響該CRISPR / Cas9基因編輯方法對DMD的安全性或功效。

“因為肌營養(yǎng)不良蛋白基因已經(jīng)存在缺陷，在這種情況下，這些編輯情況不一定會引起關(guān)注。盡管如此，任何意想不到的結(jié)果都可能會剝奪你試圖實現(xiàn)的基因編輯的效率，這支持了設(shè)計在未來研究中客觀地識別和減輕替代編輯的方法的重要性。”

“以前的研究表明，其中一些類型的編輯可能會發(fā)生，但這是使用治療相關(guān)方法對動物模型中這些事件進行的綜合測量之一。展望未來，需要仔細監(jiān)測這一現(xiàn)象并更好地理解。避免這些替代編輯并增加預(yù)期頻率的方法編輯對于大限度地發(fā)揮基因組編輯治療疾病的潛力非常重要。“